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上海聯(lián)碩生物科技有限公司
中級會(huì)員 | 第17年

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HRP標(biāo)記抗體之戊二醛二步法

時(shí)間:2011/12/23閱讀:1901
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                                                 HRP標(biāo)記抗體之戊二醛二步法 

1. 原理
戊二醛為一種雙功能試劑,通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價(jià)結(jié)合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物。
2. 試劑及器材
(1)0.1M PH6.8磷酸緩沖鹽水(PBS):取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml,NaCl1.8克,加蒸餾水至200ml。
(2)1.25%戊二醛液:取25%戊二醛50ml與PH6.8的PBS 1ml混合。
(3)1M PH9.5碳酸鹽緩沖液:取1M碳酸鈉3ml與1M碳酸氫鈉7ml混合。
(4)0.2M賴氨酸溶液:稱賴氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸緩沖液1ml中。
(5)0.15M PH7.4 PBS及生理鹽水。
(6)PH7.8飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。
(7)萘氏試劑及聚乙二醇(PEG,MW2000)。
(8)純化的特異性抗體或抗Ig抗體。
(9)HRP(RZ>3.0)。
(10)Sephadex G-25層析柱(2cm×50cm)。
(11)攪拌器,分光光度計(jì),離心機(jī)。
(12)透析袋,大、小燒杯,試管,吸管等
3. 標(biāo)記步驟
(1)稱取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中,于室溫靜置過夜。
(2)反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱,用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml/1分鐘,收集棕色流出液。如體積大于5ml,則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中,緩慢攪拌。
(3)將待標(biāo)記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml,攪拌下逐滴加入酶溶液中。
(4)用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml,繼續(xù)攪拌3小時(shí)。
(5)加0.2M賴氨酸0.25ml,混勻后,置室溫2小時(shí)。
(6)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨,置4℃ 1小時(shí)。
(7)3000rpm離心半小時(shí),棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次,zui后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
(8)將上述溶液裝入透析袋中,對0.15M PH7.4的PBS緩沖鹽水透析,去除銨離子后(用萘氏試劑檢測),10,000rpm離心30分鐘去除沉淀,上清液即為酶結(jié)合物,分裝后,冰凍保存。
4. 結(jié)果判定
(1)定性及效價(jià)滴定:用特異性抗原(或抗體)同酶標(biāo)記抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)或免疫電泳試驗(yàn)。然后用酶的底物使沉淀弧顯色,可初步鑒定其活性。zui后以直接ELISA法(或在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里)對酶結(jié)合物進(jìn)行滴定( 見本節(jié) (三)工作濃度的選擇)。
(2)定量和克分子比值測定:可用分光光度計(jì)測定(光程1cm)。
酶量(mg/ml)=OD403nm×0.4
IgG量(mg/ml)=(OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62
(3本法標(biāo)記步驟比較簡單,重復(fù)性好。缺點(diǎn)是酶的利用率低,一般只有2-4%的酶與蛋白質(zhì)結(jié)合。

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