原核注射实验
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- 公司名称 上海达为科生物科技有限公司
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- 厂商性质 生产厂家
- 更新时间 2025/7/10 13:24:53
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一、技术定义与核心原理
原核注射是将外源DNA直接注入受精卵的雄性原核（体积较大且易定位），使外源基因随机整合至宿主基因组的技术。其核心机制包括：
随机整合：外源DNA通过非同源末端连接（NHEJ）插入染色体，整合位点与拷贝数不可控。
原核优势：雄性原核（由精子形成）比雌性原核更易定位，且DNA修复活性高。
瞬时表达窗口：受精卵处于单细胞期，DNA修复系统活跃，利于外源片段整合。
生物学基础：
受精后12-24小时为最佳操作窗口（小鼠），此时原核清晰可见。
二、标准化操作流程
（一）前期准备
| 步骤 | 关键操作与参数 |
|---|---|
| 载体构建 | 线性化载体（避免质粒骨架整合） + 必需元件（启动子、编码区、polyA） |
| 受精卵获取 | 超排卵处理雌鼠（PMSG/hCG）→ 与雄鼠合笼→ 取见栓后0.5天的受精卵 |
| 显微注射系统校准 | 注射针内径1-2μm，压力5-10 hPa，单次注射体积2pL（含1-2ng DNA） |
（二）注射与胚胎移植
存活率控制：注射后受精卵存活率需＞80%。
移植时机：发育至2细胞期再移植，可提高着床率。
（三）首建鼠（Founder）鉴定
基因型检测：
PCR法：提取鼠尾DNA，扩增外源基因。
Southern Blot：验证拷贝数与整合完整性。
表达验证：
Western Blot（蛋白水平）或RT-PCR（转录水平）。
首建鼠特性：
每只Founder为独立品系（因随机整合位点不同），需分别建系。
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