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所有推荐的检测 - 捕获抗体对都能以相同效率识别 BNP 前体（图中未展示）。然而，重要的是要注意，市售 BNP 检测试剂对 proBNP 的识别能力存在 18 - 20 倍的差异，因此，所有推荐的组合都已在一组 11 例 HF（心力衰竭）患者的血浆样本中进行了测试，以确保检测对 proBNP 具有同等识别能力。这一点在使用不同检测平台时尤为重要，因为需要选择在给定条件和平台下能最佳发挥作用的抗体对。

对于 BNP 免疫检测，我们建议使用重组糖基化 proBNP（C 端 + N 端 GBPs，见第 8 节）作为标准品，因为血液中 BNP 的前体主要以糖基化 proBNP 的形式存在。

校准曲线：所有推荐的 BNP 免疫检测都能识别三种具有相同效率的 BNP 前体多肽：合成 BNP、重组非糖基化 proBNP 和重组糖基化 proBNP。图 5 展示了 9M1 - 24C5（A）和 5T4 - 12（B）两种基于抗体的免疫检测的代表性校准曲线。我们之前已详细描述过 9M1 - 24C5 免疫检测，并在内部测试中证明了其分析灵敏度（使用合成 BNP 作为校准品时）优于 0.05 pg/ml（图 7D）。其他抗体对的分析灵敏度也列于下文的识别部分。

BNP 表位与市售 BNP 检测试剂的表位具有良好的相关性：为了确定推荐的 BNP 免疫检测所识别的表位是否与市售检测试剂识别的表位相似，我们比较了两种市售检测试剂（Alforti STAT BNP 检测试剂，表位为 36 - 24 和 5 - 13；Siemens 检测试剂，表位为 26 - 12 和 12 - 2）以及我们的 9M1 - 2429 检测试剂（分别针对 26 - 12 和 12 - 2 表位）的识别情况。具有相同表位特异性的检测试剂的检测结果相关性良好。用 BNP 免疫检测（9M1 - 2429）获得的检测结果与 Alforti STAT BNP 检测试剂（图 6A）和 Siemens BNP 检测试剂（图 6B）的检测结果相关性良好。使用针对 26 - 12 和 12 - 2 表位的检测试剂获得的结果与针对 37 - 24 和 14 - 21 表位的 Siemens 检测试剂（图 6B）的结果相关性良好。我们的一种检测试剂（5M1 - 130）与 Siemens 检测试剂（r = 0.97）也显示出良好的相关性。

每种检测试剂都使用内部标准物质进行校准。市售检测试剂的表位特异性可在 IFCC 网站上查询。

脑啡肽酶抑制及其对BNP免疫检测的影响

通过阻止内源性BNP的降解来增加其水平，被认为是心力衰竭（HF）治疗的一种潜在策略。最近，一种名为Entresto®（“诺欣妥”，译者注  ）的药物已获批准用于HF治疗。该药物的活性成分之一是脑啡肽酶抑制剂，有观点认为，给HF患者使用这种抑制剂，会使BNP前体肽（proBNP）相关分子的水平升高  。

市售BNP检测试剂的设计通?；谑侗鹆街直砦坏目固宥?，至少其中一种表位针对BNP分子的C端结构，另一种表位针对BNP环结构（见图2中的17 - 118序列）。鉴于脑啡肽酶切割位点位于环结构，合理推测识别环结构表位的免疫检测抗体，在脑啡肽酶改变proBNP的情况下，可能会受到影响。然而，HF患者中proBNP的复杂多样性，以及心脏分泌的proBNP活性形式的多样性，意味着这个问题没有简单答案。

我们研究了脑啡肽酶活性对多种BNP免疫检测的影响，方法是将proBNP暴露于脑啡肽酶。令人惊讶的是，proBNP对脑啡肽酶具有抗性。3C4 - 3G12对脑啡肽酶的抗性似乎是由于脑啡肽酶切割表位的抗性。而捕获抗体识别环结构的检测试剂，如5T4 - 12，确实会因脑啡肽酶切割而受影响，这与预期一致  。我们发现5T4 - 12对脑啡肽酶切割敏感，而5T4 - 32也对脑啡肽酶作用有抗性（数据未展示）。

我们还发现，未经过处理的proBNP（它是BNP免疫检测中主要的待测分子形式）实际上不会被脑啡肽酶切割，因此，仅设计用于检测BNP的试剂，不会受到此类药物（指脑啡肽酶抑制剂类药物  ）的影响  。

NT - proBNP检测试剂的研发

NT - proBNP是proBNP的N端部分，包含76个氨基酸，有7个糖基化位点。已发现NT - proBNP的生物活性仅为BNP的1/1000，这在一定程度上意味着，在临床样本中，NT - proBNP更稳定。计算得出的NT - proBNP等电点为8.45，分子质量为8.54 kDa。但由于糖基化，其表观分子质量更高  。

糖基化对NT - proBNP检测的影响

我们的研究表明，NT - proBNP的糖基化会对某些抗体的识别产生负面影响。NT - proBNP分子的中央区域（如28 - 56位）因去糖基化而容易被抗体识别，而13 - 27位和61 - 76位区域的糖基化则已被充分认识  。

为了减少糖基化对NT - proBNP测量的影响，我们使用了来自8例HF患者的样本，这些样本在去糖基化前后，分别用两种检测试剂进行检测：一种检测试剂的抗体对针对无 糖基化位点（15C4 - 13G12），另一种检测试剂的抗体对针对糖基化位点（11D1 - 13G12）。图7显示，去糖基化对后一种检测试剂的检测结果有显著影响。

在检测NT - proBNP时，糖基化及其对检测的影响应在检测试剂研发过程中予以考虑。建议选择对糖基化不太敏感的抗体  。

图7  糖基化对NT - proBNP检测有不同程度的影响

使用两种不同的免疫检测方法（A为Alforti NT - proBNP检测试剂，识别无 糖基化表位；B为针对糖基化表位的检测试剂  ），对8例HF患者样本在去糖基化前后的样本进行检测。两种检测试剂在检测天然（糖基化）形式（黑色圆点）和去糖基化形式（红色圆点）的NT - proBNP时，结果差异显著。在A检测试剂中，去糖基化几乎不影响检测；而在B检测试剂中，去糖基化会使检测信号大幅改变  。

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