免疫印跡（Western blot, WB）是分子生物學(xué)中檢測復(fù)雜生物提取物中特定蛋白質(zhì)存在的常用方法之一。WB必須控制上樣量以確保目標(biāo)蛋白變化具有可比性，通常選擇在所有組織中普遍分布的具有相對恒定量的蛋白質(zhì)作為內(nèi)參（Loading control）。
為何要選用內(nèi)參
在Western Blotting中使用內(nèi)參就是在試驗中另外用內(nèi)參對應(yīng)的抗體檢測內(nèi)參蛋白。內(nèi)參就是內(nèi)部參照，一般是指管家基因編碼表達(dá)的蛋白，它們在各個組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在檢測蛋白的表達(dá)水平變化時常用它來做參照。
如何選擇內(nèi)參抗體
1.樣本種屬來源
選擇內(nèi)參首先要考慮的就是實驗樣本來源于什么物種。哺乳動物的組織或者細(xì)胞樣本，通常選擇β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Na+/K+-ATPase, Histone H3 等。植物來源實驗樣本，則可以選擇Plant actin、Rubisco等。其他來源樣本研究較少，所以就應(yīng)該參照文獻(xiàn)報導(dǎo)，選擇合適的蛋白作為內(nèi)參。
2.目的蛋白分子量
選擇內(nèi)參抗體時，應(yīng)該考慮目的蛋白分子量的大小。通常應(yīng)該保證目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5KD以上。比如檢測目的蛋白分子量為45KD，此時不適宜選擇β-actin（42KD）作為內(nèi)參，可以考慮選擇GAPDH（36KD）作為內(nèi)參。
3.目的蛋白表達(dá)部位
就一般的蛋白檢測來說，β-actin、β-Tubulin抗體等就可以了，而針對于核蛋白的定量，特別是樣本蛋白就是核蛋白時，選擇恰當(dāng)?shù)暮说鞍變?nèi)參則更能體現(xiàn)內(nèi)部參照的價值。常用的核內(nèi)參抗體有Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其它常見的核蛋白內(nèi)參還有PCNA、K70、K80等，在一些文獻(xiàn)報道中，Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。而對于膜蛋白檢測，常用的內(nèi)參抗體為Na,K ATPase。對于線粒體蛋白的檢測，常用VDAC1和COX IV作為內(nèi)參抗體。內(nèi)參的選擇需要考慮實際的試驗環(huán)境，比如某些細(xì)胞中，由于組織缺氧、糖尿病等因素會導(dǎo)致GAPDH的表達(dá)增高，不適合做內(nèi)參。比如在在凋亡實驗時，Lamin等也不適合作為內(nèi)參。因此設(shè)計實驗方案的時候應(yīng)該考慮這些因素并查詢相應(yīng)文獻(xiàn)，在實驗過程中也應(yīng)該注意如果內(nèi)參表達(dá)出現(xiàn)異常，應(yīng)考慮這方面因素。
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