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多重熒光探針PCR檢測試劑盒的使用方法
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1g，手術剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm 離心2min，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中；棉拭子直接取100μL提取。
1.2RNA提取
推薦采用RNA提取試劑盒（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進行操作。
2.試劑配制（試劑準備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的PCR反應管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照；樣品每滿7份，多配制1份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑AIV-H7N9 反應液 酶液
用量20μL 1μL
將混合好的測試反應液分裝到PCR反應管中，21uL/管。
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟1提取的RNA、陽性質控品、陰性質控品各取4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4.PCR擴增（核酸擴增區(qū)）
4.1將待檢測反應管置于熒光定量PCR 儀反應槽內；
4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為25μL；熒光通道選擇：檢測通道（Reporter Dye）FAM、CY5，淬滅通道（Quencher Dye）選擇NONE，ABI系列儀器請勿選擇ROX參比熒光，選擇None即可。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置：
步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號
1 1cycle 42℃ 20min 否
2 1cycle 95℃ 10min 否
3 40cycle 94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
5.結果分析判定
5.1結果分析條件設定
設置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內調節(jié))、stop 值(一般可在5~20范圍內調節(jié))，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。
5.2結果判斷
FAM通道為禽流感病毒H7N9亞型H7基因檢測結果，CY5通道為禽流感病毒
H7N9亞型N9基因檢測結果
陽性：檢測通道Ct值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。
可疑：檢測通道Ct值>35.0，且出現(xiàn)明顯擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結果出現(xiàn)Ct值≤35.0和明顯擴增曲線者為陽性，否則為陰性。
陰性：樣本檢測結果無Ct值且無明顯的擴增曲線。
6.檢測方法的局限性
樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；
樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結果；
陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；
病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；
不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；
試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定
量檢測不準確的結果；
本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
7.質控標準
陰性質控品：無明顯擴增曲線且無Ct值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且Ct值≤32；
以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。