亚洲精品综合日韩中文字幕网站_精品综合久久久久97_中文在线天堂网www_久久精品免费一区二区三区_91久久国产综合精品女同国语_久久资源总站在线国产成人

螯蝦瘟（絲囊霉菌）熒光 PCR 檢測試劑盒說明書

最近更新時間：2018-1-18

提 供 商：上海研生實業(yè)有限公司資料大?。?/span>116.1KB

文件類型：JPG 圖片下載次數(shù)：21次

資料類型：瀏覽次數(shù)：299次

相關(guān)產(chǎn)品：

1、 螯蝦瘟(絲囊霉菌)熒光 PCR檢測試劑盒簡介 
貨號：HB-811-1 
螯蝦瘟的病原體是絲囊霉菌，現(xiàn)可將絲囊霉菌分為 A 到 D 四個型。迄今為止，所以淡水螯蝦都
對絲囊霉菌易感，甲殼表皮zui先被感染，腹側(cè)與腹部接合處周圍的軟表皮zui易被感染。高度易感的
螯蝦品種在感染后短時間內(nèi)就可達(dá)到很高的死亡率。為了適應(yīng)螯蝦瘟（絲囊霉菌）快速檢測和疫病
研究的需要，本公司根據(jù) OIE 手冊中提供的 MGB 熒光 PCR 引物和探針序列和信息并在其基礎(chǔ)上優(yōu)化
改進(jìn)，開發(fā)了本試劑盒。應(yīng)用本試劑盒進(jìn)行檢測具有快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確、安全操作簡單、
應(yīng)用廣泛和高通量檢測等特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)。
2、試劑盒組成 
試劑盒組成包括核酸提取試劑和核酸擴(kuò)增試劑，具體組成參見表 1：
表 1：試劑盒組成（50test/盒）
組成成分 體積
樣品 DNA 提取液 1
樣品 DNA 提取液 2
5ml×1 管
500µl×1 管
核酸擴(kuò)增試劑： DEPC 水
螯蝦瘟熒光 PCR 反應(yīng)液
Taq 酶(5U/ul)
陰性對照
螯蝦瘟熒光陽性對照
5ml×1 管
750µl×1 管
40µl×1 管
1ml×1 管
1ml×1 管
螯蝦瘟(絲囊霉菌)熒光 PCR檢測試劑盒*保存條件：樣品 DNA 提取液 1、2 和試劑盒須在-20℃保存。 
3、樣本采集，存放及運(yùn)輸 
3.1 樣本采集：所用取樣器材必須經(jīng)高壓滅菌并烘干。
活螯蝦從采樣到運(yùn)至實驗室檢測所用時間不應(yīng)超過24h。如在疑似螯蝦瘟暴發(fā)的地區(qū)僅能找到死
亡螯蝦，也可采集這些樣品用于診斷。根據(jù)具體情況，可采用：a冷藏運(yùn)輸（如新近死亡的螯蝦），
或b保存在zui低濃度為70%的乙醇中。取高度易感品種的腹部軟表皮zui適用于提取樣品DNA，首先清除
腹部軟表皮表面的污染物，用經(jīng)高壓滅菌和水蒸氣處理的一次性濕紙巾*擦拭腹部軟表皮，切取
30-50mg的組織并置于研缽中研磨。為了確診，可從腹部軟表皮、尾節(jié)和尾足分別取30-50mg的組織
并予以分別處理。按照試劑盒配套的DNA 抽提試劑操作說明提取DNA模板。
3.2存放：研磨后的樣本在2 ℃-8 ℃條件下保存應(yīng)不超過24 h；-70 ℃以下可長期保存，但應(yīng)避免
反復(fù)凍融（zui多凍融3次）。
3.3 運(yùn)輸：采用泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。 
4、檢測步驟 
4.1 DNA 核酸提取操作方法(在樣本處理區(qū)進(jìn)行)： 
4.1.1 取 n 個 1.5ml 滅菌 Eppendorf 管，其中 n 為待檢樣品數(shù)和一管陰性對照之和，對每個管進(jìn)行
編號標(biāo)記。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板，無需提取核酸)
4.1.2 每管加入 100 µl DNA 提取液 1，然后分別加入待測樣本和陰性對照各 100µl，一份樣本換用
一個吸頭；混勻器上震蕩混勻 5 s,于 4℃～25℃條件下，12 000 r/min 離心 10 min。
4.1.3 盡可能吸棄上清且不碰沉淀，再加入 10µl DNA 提取液 2，混勻器上震蕩混勻 5s,于 4℃～25℃
條件下，2 000 r/min 離心 10 s。
4.1.4 100℃ 干浴或沸水浴 10 min；加入 90µl DEPC 水，12 000 r/min 離心 10 min，吸取上清，
即為提取的 DNA，冰上保存待用（提取的 DNA 需在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增或放置于-70℃冰箱內(nèi)保存）。
4.2 熒光 PCR 檢測 
4.2.1 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行）：
從試劑盒中取出相應(yīng)的熒光 PCR 反應(yīng)液、Taq 酶，2000×g 離心 5 秒鐘。每個樣品測試反應(yīng)體系
配制見下表 2。
表 2 每個樣品測試反應(yīng)體系配制表
試劑 熒光 PCR 反應(yīng)液 Taq 酶 合計
用量 14.5 μL 0.5μL 15μL
4.2.2 加樣（樣本處理區(qū)進(jìn)行）：
向每個熒光 PCR 管孔中各分裝 15μL 的混合液，再分別加入樣本 DNA 模板 10μL，蓋緊管蓋，
500 r/min 離心 30 s。
4.2.3 PCR 檢測（在檢測區(qū)進(jìn)行）：
循環(huán)條件設(shè)置：
*階段，95℃/3 min；
第二階段，95℃/15 sec，58℃/1 min，50 個循環(huán)；在第二階段每次循環(huán)的退火延伸時收集熒
光。試驗檢測結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和 Ct 值判定結(jié)果。
5、結(jié)果判定 
5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
直接讀取檢測結(jié)果。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣
品擴(kuò)增曲線的zui高點(diǎn)為準(zhǔn)。
5.2 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
5.2.1 陰性對照無 Ct 值或無擴(kuò)增曲線。
5.2.2 陽性對照的 Ct 值應(yīng)<25.0，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。否則，此次實驗視為無效。
5.3 結(jié)果描述及判定
5.3.1 陰性：無Ct值或無擴(kuò)增曲線，示樣品中無螯蝦瘟（絲囊霉菌）核酸。
5.3.2 陽性：Ct值≤30，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，示樣品中存在螯蝦瘟（絲囊霉菌）核酸。
5.3.3 有效原則：Ct>30的樣本建議重做。重做結(jié)果無數(shù)值者為陰性，否則為陽性。
6、螯蝦瘟(絲囊霉菌)熒光 PCR檢測試劑盒相關(guān)技術(shù)信息 
正向引物 AphAstITS-39F(5`AAG-GCT-TGT-GCT-GGG-ATG-TT-3`)
反向引物 AphAstITS-97R（5`-CTT-CTT-GCG-AAA-CCT-TCT-GCT-A-3`）
TaqMan MGB 探針為 AphAstITS-60T（5`-6-FAM-TTC-GGG-ACG-ACC-CMGBNF-Q-3`）

[ 打印 ] [ 返回頂部 ] [ 關(guān)閉 ]